Cholesterol prijímame z potravy - mäso, mliečne výrobky a endogénne vďaka syntéze prebiehajúcej predovšetkým v pečeni (10 %), ďalej v črevách (15 %), nadobličkách a pohlavných orgánoch. Ide o pomerne zložitú a komplexnú syntetizáciu pozostávajúcu z 37 krokov, počnúc mevalonátovou alebo HMG-CoA reduktázovou dráhou a končiac lanisterolom konvertovaným na cholesterol.
Cholesterol tvorí súčasť bunkových membrán (približne na každé dve molekuly fosfolipidov pripadá jedna molekula cholesterolu. Stabilizuje ich štruktúru väzbami hydroxylových skupín s polárnymi časťami fosfolipidov a sfingolipidov a väzbou steroidnej časti cholesterolu s reťazcami mastných kyselín. Zaisťuje permeabilitu membrán (predovšetkým pre malé molekuly) odďaľovaním fosfolipidov, ktoré potom nemôžu kryštalizovať. Je súčasťou aj membrán intracelulárnych organel (mitochondrií, endoplazmatického retikula). Podieľa sa na medzibunkovej komunikácii (intracelulárny transport, prenos nervových vzruchov, bunkových signálov)
Cholesterol sa podieľa ako mediátor alebo prekurzor na mnohých signálnych dráhach, pomáha pri tvorbe lipidových raftov v plazmatickej membráne, čo prináša receptorové proteíny do tesnej blízkosti s vysokými koncentráciami molekúl. Vo viacerých vrstvách môžu cholesterol a fosfolipidy, oba elektrické izolátory, uľahčiť prenos elektrických impulzov pozdĺž nervového tkaniva. Pre mnohé neurónové vlákna poskytuje izoláciu pre účinnejšie vedenie impulzov myelínová brána bohatá na cholesterol, pretože je odvodená zo zhutnených vrstiev membrány Schwannových buniek . Demyelinizácia (strata niektorých z týchto Schwannových buniek) sa považuje za súčasť základu roztrúsenej sklerózy .
Cholesterol sa viaže a ovplyvňuje signály iónových kanálov , ako je nikotínový receptor acetylcholínu, GABA A receptor, a usmerňovača draslíkového kanála. Cholesterol tiež aktivuje receptor alfa estrogén (ERRα). Konštitutívne aktívny charakter receptora možno vysvetliť skutočnosťou, že cholesterol je v tele všadeprítomný. Inhibícia ERRα signalizácie znížením produkcie cholesterolu bola identifikovaná ako kľúčový mediátor účinkov statínov a bisfosfonátov na kosti, svaly a makrofágy .
V bunkách je cholesterol tiež prekurzorovou molekulou pre niekoľko biochemických dráh . Je to napríklad prekurzorová molekula pre syntézu vitamínu D v metabolizme vápnika a všetkých steroidných hormónov , vrátane hormónov nadobličiek kortizolu a aldosterónu , ako aj pohlavných hormónov progesterónu , estrogénov a testosterónu a ich derivátov. Cholesterol sa v tele recykluje . Pečeň vylučuje cholesterol do žlčových tekutín, ktoré sa potom ukladajú v žlčníku, ktorý ho potom vylučuje v neesterifikovanej forme (žlčou) do tráviaceho traktu. Asi 50 % vylúčeného cholesterolu sa reabsorbuje tenkým črevom späť do krvného obehu.